实时荧光定量PCR（qPCR）技术方法陈述

实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。

①荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中zui 常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。

优点：价格相对较低；使用方便；对DNA模板没有选择，通用性好；检测灵敏度高。

缺点：可能产生假阳性结果，需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性；需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增；不适合进行多重qPCR检测。

②荧光探针法（TaqMan技术）：TaqMan探针是早用于定量的方法，也是临床检测中zui常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5'端标记一个荧光报告基团（Reporter, R），3'端标记一个淬灭基团（Quencher, Q）。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时（在延伸阶段），探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成wan全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。

优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测；PCR后续无需处理，节省时间和原料成本。

缺点：需要根据不同的序列，合成不同的探针；探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性，定量时容易受试剂和酶性能影响；淬灭难以完，本底较高；检测结果很难判断实际的扩增特性。                        

注：多重PCR，也称多重引物PCR或复合PCR，是在一个反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的一种新型PCR扩增技术。